彭惠君, 徐香綢, 吳重進,
看見醫事檢驗所,
一、前言
B型肝炎病毒（Hepatitis
B Virus, HBV）感染，是我國重要的公衛問題。慢性B型感染的臨床徵狀，從無症狀的不活動帶原到嚴重肝臟疾病包括肝硬化、肝癌等均是。
HBV基因組的S
gene 編碼為三種表面蛋白（Surface
protein）：Large-，Middle-及Small-HBsAg。此三種表面蛋白在C-terminal的226個胺基酸，是相同的。Small-HBsAg的中央區域第99﹣169號胺基酸，被稱為「主要親水性區」（Major
Hydrophilic Region，MHR），區域內帶有許多B細胞的
epitope。其中，具有免疫優勢（immunodominant）的第124-147個胺基酸，被稱為「抗原決定位a」（a
epitope，下稱），為中和性抗體以為目標的epitope。一些具有a
epitope內或a
epitope周圍胺基酸置換性突變的變異株，已被發現於病人檢體中。這些變異株，有些對Anti-HBs的親合力下降，有些會躲過市售HBsAg
ELISA試劑組的偵測1。
S.
J. Messenas等人在其研究中2，發現HBsAg與Anti-HBs均呈陽性的病人，有相當高的比例，是a
epitope變異株的帶原者（89﹪，n=9）。在該研究中，在HBsAg與Anti-HBs均呈陽性的病人，所發現的a
epitope突變的型式，計有T123A，I126S/T及T140I。然而，在HBsAg陽性、Anti-HBs陰性的帶原者，亦發現T140I，Q129R及I126T。可見，a
epitope的變異，仍可見於HBsAg陽性、Anti-HBs陰性的帶原者。若要探討a
epitope突變與HBsAg／Anti-HBs均呈陽性之關係，對於HBsAg陽性、Anti-HBs陰性帶原者之a
epitope變異情形，有事先瞭解之必要。本研究之目的，即在瞭解HBsAg陽性、Anti-HBs陰性帶原者，其HBV之a
epitope之變異情形。
樣本與學清學檢查
血漿樣本取自於經檢查為HBsAg陽性且Anti-HBs陰性之病人，該病人均未經任何抗病毒治療，共十份。HBsAg係以「普生正肝酶
B-96(TMB)」檢測，Anti-HBs係以「普生保肝酶
B-96(TMB)」檢測。
PCR及定序病毒DNA由200μl之血漿以QIAamp
DNA Mini Kit (QIAGEN)依原廠說明書操作萃取出。在定序前，以PCR增幅出包含a
epitope之HBV
S gene片段。PCR所用之引子為：forward
RTase
F0 ：5’-GGGACCCTGCACCGAAC-3’及
Reverse RTase
R2：5’-CCCAACTTCCAATTACATATCCCA-3’。PCR的操作，混合液由
qMaster
PCR master-mix 12.5 mL、primers
0.27 mM所組成，加入HBV
DNA 5mL
。依95°C，30秒；60
°C，30秒；72°C，45秒之條件，進行45個熱循環。PCR產物繼之以RTase
F0為引子在ABI
Prism 3100定序儀進行定序。
HBV基因分型病毒基因序列以MEGA
4.0軟體排序，加入HBV基因型A-H參考株序列，以UPGMA方法進行遺傳距離分析（phylogenetic
analysis）。
三、結果
所分析之10份樣本，均可以PCR增幅出含a
epitope之S
gene片段（如表一）。檢視此十份檢體之DNA序列，其中8份在a
epitope（a.a.
124-147）發生置換性突變，機率為80%（n=10）。
在所有a
epitope胺基酸突變中，共發現有：P142L，S143T及G145R/A等四種胺基酸置換性突變（如圖一）。其發生比例分別為：11.1%，77.8%及11.1%。此十份檢體之a
epitope序列，
並未發現有I126S、T140I兩種突變。
為瞭解上述發現之a
epitope胺基酸突變，與病毒基因型之關係，將上述DNA序列進行遺傳距離分析，以測定病毒之基因型，結果如圖二。10份檢體中，有八份為genotype
B，二份為genotype
C。值得注意的是S143T這個胺基酸突變，本研究中的所有genotype
B均為S143T，而genotype
C則未發現突變。
四、討論
HBV相對於其他DNA病毒，突變率高，因其DNA
polymerase係為不具proof
reading之RTase。因此，在探討某病毒基因突變對病毒之活動、致病機轉或臨床表徵之影響時，必需小心鑑別出哪些突變是有相關性的。本研究設定以HBsAg陽性且Anti-HBs陰性之未曾治療病人為範圍，闡述其HBV
a epitope突變情況：
共有
P142L、S143T及G145R/A等四種胺基酸置換性突變，其中發生率最高者為S143T。而S143T似又與HBV基因型有關，本研究中的HBV
genotype B均帶有此種突變，而genotype
C則無此種突變。
常見的與免疫逃避（immune
escape）有關之HBV
a epitope突變有：
G145R，D144A，
P142S，Q129H，I/T126N/A及M133L3。O. Lada
4則發現，在HBsAg/Anti-HBs同時呈陽性的病人，其HBV
a epitope發生 G145R，I/T126N/S，
Q129N及D144A的機率高。在本研究中，除
G145R外，HBsAg
陽性、Anti-HBs陰性的帶原者，其HBV
a epitope
並未發生上述突變，可見上述突變與免疫生成性（immunogenicity）的改變有關。特別值得注意的是G145R，多數研究普遍認定該突變與免疫逃避有關，但所遺憾者，本研究無法觀察該病人的臨床表現。
有關HBV
a epitope變異株之研究，有增加之情形，然而卻鮮少提及
a epitope變異株與HBV基因型之關係。僅管a
epitope被認為在HBV各基因型是具高度保留性的，但在該區域內的第143號胺基酸，常見的形式是S143，然而在本研究中，基因型B卻均以T143型式存在，基因型C則否。T143在HBV基因型B究竟是變異株，抑或是wild
type？在論斷之前，有必要先瞭該地區HBV各基因在型在a
epitope基因差異性情形。至少，本研究提出T143可能在HBV基因型B佔有高比例之假設，以待更大規模檢體樣本之研究。
最後，提出結論：
常見於HBsAg/Anti-HBs均呈陽性之I126T、T140I等抗原決定位a編碼區之突變，似非普遍存在於B型肝炎表面抗原陽性病人之病毒中，亦與基因型無關。S143T發生於genotype
B之機率，高於genotype
C，似與基因型有關。此結果可作為後續大規模篩檢之參考依據。
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