徐香綢, 彭惠君, 吳重進
看見醫事檢驗所
一、前言
在B型肝炎治療的臨床實務中，貝樂克（Entecavir，下稱ETV）是目前首選的口服抗病毒藥之一。因為，ETV毒性低且其對HBV
DNA polymerase抑制能力強。更重要的是，ETV較不容易誘發出抗藥性株1。對於未曾接受任何口服抗病毒藥的病人，接受ETV治療一段時間而產生抗藥性是罕見的：在96週的療程中，因產生抗藥性而病毒量反彈的情形不到1%。本文所要陳述者，為一特殊案例：病患在接受ETV治療前，並未接受任口服抗病藥的治療；然而，該病患的治療成果不佳。醫師疑有抗藥性突變產生，遂檢視病毒基因序列，發現病毒基因的YMDD
motif突變為YIDD，並不是一般公認的ETV抗藥性突變。病人既係在ETV治療前未曾接受其他口服藥治療，則此突變究係ETV治療前病毒自發性突變，抑或是在ETV治療期間所誘發？該種突變是否與病毒抗藥性有關？為本文所探討之重心。
二、案例報告
病患甲，在2009年經乙醫院診斷為慢性B型肝炎，繼而接受ETV治療。治療前檢查甲之基礎病毒量（baseline
viral load），為768,400,000
IU/mL；之後，在治療期間的第0.5年、第1年、第二年及第三年，分別以即時定量PCR監測HBV病毒量，如表一。從臨床實務的角度，甲之預後不佳，因據研究2：在ETV治療的兩年內，有81﹪的病人其病毒量會降至300
copies/mL以下，然而甲在兩年內仍未降至300
copies/mL以下。直至2012年6月才達到「顯著病毒反應」（Sustained
Viral Response，SVR）。
由於治療的病毒反應不佳，醫師疑有抗藥性突變發生，或因其他藥物的抗藥性突變產生交叉反應，遂檢病毒基因序列，檢視是否有其他口服抗病毒如Lamivudine等之抗藥性突變。從病人血漿中，使用QIAamp
DNA Mini Kit (QIAGEN)萃取HBV
DNA。繼之，以引子對Forward
RTase
F0：5’
- GGGACCCTGCACCGAAC -3’及
Reverse RTase
R2：
5’- CCCAACTTCCAATTACATATCCCA -3’進行PCR，增幅HBV
P gene的RTase區域之片段，該片包含YMDD
motif。反應條件如下：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，45秒，進行45個熱循環。
PCR產物以RTase
FS1：5’
- TTG TCC TGG TTA TCG CTG GAT-3’為引子，於ABI
Prism 3100定序儀進行定序。定序結果如圖一，除了wild
type（YMDD）以外，也出現了YMDD
motif 突變為YIDD（或稱M204I）之突變株。
YIDD是常見的Lamivudine抗藥性突變型式之一，但病患自陳ETV治療前並未接受其他口服抗病毒藥治療。可能的解釋是，病人在ETV治療前，HBV之YMDD
motif 已自發性突變為YIDD。據研究3，未接受Lamivudine治療的HBV
帶原者，有12.21%會自發性產生YMDD
motif 突變，機率不可謂不高。為釐清病毒YIDD之突變，究係ETV治療前已發生，抑或是ETV治療期間所發生，我們進一步將病患ETV治療前及治療期間之四份檢體，均以上述方法檢視HBV
YMDD motif。
如圖二，HBV
YMDD motif 在ETV治療前，仍是wild
type （即YMDD），一直維持到治療後的第2.5年達到「顯著病毒反應」時，始出現YIDD型式。由此可見，此YIDD是在ETV治療期間產生YMDD
motif 突變，並非ETV治療前的自發性突變。
三、討論
在本文中，陳述了一位未曾接受任何口服抗病毒藥治療的慢性B型肝炎病患，在ETV療程中體內HBV發生了YMDD
motif 的置換性突變，由M204突變為M204I。HBV在ETV治療的至少1.5年內，並未產生突變，直到治療達到顯著病毒反應，經檢驗發現產生M204I突變。因ETV在未接受口服抗病毒藥治療的病患，產生抗藥性突變的機率小於1%，而所產生的突變又非目前已確定的抗藥性突變，其臨床意義值得注意。
一般而言，ETV對於曾接受Ｌamivudine治療的病患，雖有部份療效，但產生抗藥性突變的機率也提高到兩年內10%4。因此，對於因Lamivudine治療而復發的病人，ETV的療程不宜過長4。目前已確認出的ETV抗藥性突變是：rtT184G、rtS202I
或
rtM250V；然而，其先決條件是，必需還要有「rtL180M+rtM204V」，此即Lamivudine常見的抗藥性突變之一4。至於另一常見的Lamivudine抗藥性突變rtM204I，合併
rtT184G、rtS202I
或
rtM250V其中之一，目前為止並未有相關的案例報告。而在本例中，HBV雖有M204I的突變，但並沒有合併rtT184G、rtS202I
或
rtM250V等突變。該病毒是否會進一步發生rtT184G、rtS202I
或
rtM250V等突變，尚屬未知；若病人尚未終止療程，鞏固治療期間的病毒基因變化，值得繼續觀察。
由檢查結果得知病毒現有
rtM204I 突變，是否會導致日後病毒反彈（vrial
relapse）？在Motokazu等人的研究中5，rtM204I的發生，與ETV療程中病毒反彈之發生，並無顯著相關。並且，該研究提出了ETV抗藥性發生之機制：T184L和S202G（此二胺基酸位於HBV
RTase的掌心部位）改變了D205胺基酸的方向，使得dNTP的結合區域窄化，並提高了ETV與該區域結合的位能，從而降低了ETV結合的親和力，因而造成了L180M+M204V+S202G（或T184L）的突變對ETV的抗藥性5。該研究未對M204I進行相同的3D模型模擬，推測是由於統計顯示M204I與病毒反彈無關，故無進行之必要。果若如此，病患或許不至於因M204I的發生而導致病毒反彈現象。
HBV
RT區域的基因序列變化，對於HBV的口服抗病毒治療相當重要，不論是在治療前或療程中。在治療前，可用以評估藥物之採用及劑量療程之決定；在療程中，可用以預測抗藥性之發生及更換藥物之決定。在本案例中，治療前並未檢查病毒的
HBV RT區域基因序列，致對於療效發生疑慮；而後發現病毒發生M204I突變，設若病人需要更換口服抗病毒藥，即應考慮不宜選擇對M204I無感受性之藥物。
雖然M204I之出現，對病人病情後續之發展仍待觀察，但本案例加強了HBV
RT區域基因序列變化檢查的臨床重要性。
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