徐香綢, 彭惠君, 張朕佳
看見醫事檢驗所
一、前言
人類免疫缺乏病毒（Human
Immunodeficiency Virus, 下稱HIV），可分為三個group：group
M (Major)、group
O (Outlier) 及
group N (non-M/non-O)，其中Group
M在全世界的盛行率佔了絕大部份（＞90%）。Group
M依其遺傳距離可進一步區分成亞型（subtype，又稱clade，以大寫拉丁字母表示）及次亞型（sub-subtype，以數字表示），目前確認的亞型及其次亞型，分別是
A1、A2、
A3、
A4、
B、C、
D、F1、F2、G、H、J
及
K。過去幾年來，由於HIV的全基因組定序之進展，又確定出了「循環重組形式」（circulating
recombinant forms，下稱CRF）
及「單一重組形式」（unique
recombinant forms，下稱URF）等兩種變異株形式。前者係指該變異株發現於三個或以上之無直接流病關聯性的個體，否則即為後者。
不同的HIV-1亞型，據報告對病毒的適應變化、免疫生成性及致性病是有影響的，從而也影響預防及治療的方針。Laleebu等人的研究發現，若干HIV-1亞型的傳播或發病速度，較之其它亞型來的快，從而對治療方法之決定造成困擾；Snoeck等人的報告，以HIV-1
亞型B為對象，所評估出對抗病毒治療的感受性的數據，並不能適用於亞型B以外的其他亞型。因此，可預期HIV-1
亞型之分型，在臨床應用上會更加重要。
目前，HIV-1基因分型的方法，可依據基因體下的各基因片段序列（如gag、pol
或
env），或者是基因體全長序列來分析。在基因型M下的各亞型，env基因序的變異度在20-30%。pol的變異度大約是env的1/2至1/3，因為此基因編碼出兩個極其重要的酵素：RTase
(下稱RT)和protease
（下稱PR），如此區域突變過度，將使病毒無法運作。同時，此基因的序列變異意義重大，許多抗藥性突變均發生在此。另一個變異度與env等量齊觀的序列是Long
Terminal Repeat（下稱LTR），該序列包含許多的啟動子。
本研究之目的，即以
PCR及定序為基礎，分別利用HIV-1pol內的RT、PR及
LTR等三個基因片段之序列，透過遺傳距離比對進行HIV-1之亞型分型，並比較此三段基因片段，對於亞型分型結果之差異，以作為將來應用於臨床時策略決定之參考。
二、材料與方法
PCR及定序-
病毒RNA由160μl之血漿以Roche
High Pure Viral Nucleic Acid Kit依原廠說明書操作萃取出。在定序前，以RT-PCR增幅出RT、PR及LTR等三個序列片段。其中，RT和PR係進行Nested
PCR。PCR所用之引子，如表一。RT-PCR的操作，是將5
μl的HIV
RNA以各該序列的反義股引子進行逆轉錄反應，以獲得各該序列的cDNA。PCR混合液由
qGene
PCR master-mix 12.5 mL，primers
0.27 mM組成，以cDNA
5mL進行反應
。
PCR產物繼之以各正義股引子為引子，在ABI
Prism 3100定序儀進行定序。
HIV-1亞型分型-
病毒基因序列以MEGA
4.0軟體排序，加入參考株序列，以UPGMA方法進行遺傳距離分析（phylogenetic
analysis）。
三、結果
以LTR特異性引子進行PCR，15份檢體全部可增幅出一長度為120
b.p.
之DNA片段。因在本研究中所進行的是一般RT-PCR，並未使專一性探針，如以TaqMan
probe為螢光源之real-time
PCR或南方墨點法，但因後續必需定序，故仍可依序列確保PCR產物之專一性。定序結果上傳網際網路與NCBI
巨分子資料料庫比對（NCBI
BLAST, http: // blast. ncbi.
nlm.
nih.
gov/
Blast. Cgi
? CMD = Web & PAGE _TYPE = BlastHome)
，此15份檢體均為專一性產物，即HIV-1
5’-LTR之DNA片段。然而，RT
引子只增幅出11份長度為686
b.p.之DNA，PR只增幅出9份長度為 400
b.p.之DNA。依上述方法比對，均為專一性產物（表二）。
HIV-1亞型分型結果，以LTR序列進行亞型分型時，11份為亞型B，兩份為CRF06，其餘各為亞型C及CRF11（圖一）。以RT序列進行亞型分型時，11份PCR陽性之DNA序列均為亞型B（圖二）。
以PR序列進行亞型分型時，9份DNA序列中，有8份為亞型B，1份為亞型C（圖三）。
為比較此三種HIV-1基因片段作為亞型分型依據，所得結果之異同，就此三基因片段均為PCR陽性之樣本進行比較，分別是檢體編號第4、5、8、9、11、12、14及15，皆為亞型B並無差異。而以此三種HIV-1基因片段兩兩比較，即有結果之差異：第七號檢體之LTR分型為CRF11而RT分型為亞型B（表二）。
四、討論
以基因序列進行遺傳距離比對，作為基因型或亞型之分型依據時，在方法的選擇上有若干優缺必需取捨。首先，是序列的長短，序列愈長愈能完整顯示出基因上的差異。基此，基因體全長序列是最佳的材料，然而相對地較耗費人時物力，無法大規模進行或應用於臨床實務。退而求其次，以序列片段進行分型較為可行，但必需考量該基因片段的變異度。變異度大，愈能區分能力愈強，但相對地，在設計PCR引子時難度更高，因難以找到各基因型或亞型均具一致的保留性區域。反之，設計引子雖較容易，但所得基因序列所容納的變異較少，分型的準確度易受質疑。在本研究捨基因體全長序列，而改採序列片段，並比較不同基因片段分型的結果是否不同，動機即在此。
由於以基因序列片段進行比對前，需以RT-PCR將該片段增幅出，因此所使用的引子對在進行PCR時的靈敏度，成為方法選擇上首要考量的重點。本研究中所使用的LTR引子，靈敏度高於RT及PR，而RT又高於PR。此結果固然與引子對本身之性質如Tm、GC
content有關，PCR產物的長度亦不無影響。本研究的LTR產物最短，靈敏度最佳。而與RT、PR分型結果比較，有一致性。
雖然RT、PR靈敏度不若LTR，但仍有其臨床價值。目前HIV的治療，nucleotide
analogue和proteinase
inhibitor乃是主要的抗病毒藥物，而此二類藥物所篩選出的抗藥性突變，前者發生在RT區域，後者發生在PR區域。以臨床實務的角度，定出HIV-1的PR及RT基因序列，不僅可以作為分型基礎，亦可檢視是否有抗藥性突變發生。
HIV-1會進行基因重組，一如流行性感冒病毒一般，因而出現所謂的重組形式（recombinant
forms）。而所謂重組形式，不單指基因片段的重組，亦可能以「拼貼」（mosaic）的形式出現，即在同一基因片段內交錯出現不同亞型的序列。本研究中的第七號檢體，LTR分型為CRF11，而RT分型為亞型B，可能的原因即在於此HIV-1不僅是重組形式，甚有可能是拼貼的重組。
本研究的結論是，以HIV-1
5’-LTR作為HIV-1亞型分型依據，是可行的。唯若考量可能出現重組形式的HIV-1，則必需再佐以其他基因片段如RT或PR為妥。
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